奶粉中的维生素A、D3、E的测定（固相萃取-液相色谱法）

目前对奶粉中脂溶性维生素A、D3、E测定的前处理方法多采用皂化方法去除脂肪[1-7]，皂化过程后使用大量的有机溶剂进行液液萃取以洗除杂质，操作步骤复杂，维生素D3样品还需经硅胶柱做进一步的净化才能进行检测，造成实验时间成本的增加，不利于大批量样品的检测。本文研究了利用固相萃取法作为奶粉样品的前处理方法，液相色谱法作为检测手段，实现同时测定奶粉中维生素A、D3、E的含量，该方法可简化奶粉样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。

1. 样品处理

皂化提取：2g奶粉加入1mL水混匀，加入1 mL VC/乙醇溶液破壁处理，混匀，加入10mL氢氧化钾碱液（1.25g/mL），55℃条件下，水浴皂化45min，取出冷却至室温，向皂化液中加入适量无水乙醇，使之含50%乙醇，6000r/min离心5min后，取上清液，用1至2个微孔过滤器对其进行过滤，至Qdaura 卓睿™全自动固相萃取仪上样管中作为待净化液。

2. 固相萃取净化

Qdaura^TM卓睿全自动固相萃取仪程序设定：5mL甲醇，和5mL水活化，加样，10mL50%乙醇/水淋洗，抽干20min。2mL 丙酮，10mL乙酸乙酯洗脱，收集。收集液于40℃氮气吹干，1mL甲醇定容，0.45um PTFE过滤器过滤，准备进液相色谱分析。

3. 色谱条件

液相色谱仪：LC-10F

色谱柱：Venusil MP C18，4.6 mm *150 mm，5µm；

流动相：甲醇；

流速：1mL/min；

柱温：30℃；

进样量：20µL；

波长变化见表1：

表1 波长变化梯度表

4. 结果与讨论

图1 低浓度维生素标准溶液的色谱图

从左至右依次为：维生素A（5.0µg/mL）、维生素D3（9.8µg/mL）、维生素E（99µg/mL）

4.1 工作曲线及检出限

根据仪器对各个物质的响应情况，将维生素A、D3、E分别由储备液用正己烷逐级稀释，各稀释成7个浓度，维生素A浓度范围为0.25µg/mL~25µg/mL，维生素D3浓度范围为0.30µg/mL~30µg/mL，维生素E浓度范围为2.5µg/mL~250µg/mL，将溶液进HPLC进行检测，计算出检出限，回归方程及检出限见表2。可见，液相色谱仪对维生素A、D3、E的响应与浓度呈良好的线性关系。

表2 线性回归方程及检出限

图2 皂化-固相萃取法色谱图

4.2 皂化-固相萃取和传统皂化-液液萃取法的实验效果对比

传统皂化-液液萃取法参考《GB 5413.9—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E 的测定》的样品前处理2个奶粉（每个样称取2g）的平行样，作为参照。同时以皂化固相萃取法做两个平行样品。

表3 传统皂化-液液萃取法与皂化固相萃取法的实验结果对比

由于选用的奶粉VD含量较低，没有检出。

从上述对比可以看出，皂化固相萃取法相比国标的皂化液液萃取法具有简单的优势，同时萃取效果更好。*的缺点是出峰靠前的维生素A附近有较多的弱保留物质的干扰，但是依靠MP C18的强大的分离能力，可以实现分离维生素A和干扰物质的基线分离。同时这些弱保留的物质很容易被洗脱出色谱柱，所以不会对色谱柱造成较大的污染。

4.2.3加标回收率实验

表4 加标回收率及精密度

4.2.3 实际样品检测

根据所建立的方法分析了从市场上购买的3种品牌奶粉，分别编号为1号、2号和3号按照上述方法进行样品处理和检测，所得维生素A、D3和E的含量结果见表6。

图7. 2号奶粉样品色谱图

表6 奶粉中维生素含量（µg/g）

4.3 结论

采用改进后的皂化-固相萃取方法来替代传统的皂化法来测定奶粉中维生素含量，皂化能充分提取出奶粉中维生素A，D，E，再经过Cleanert Vitamin固相萃取柱进行净化吸附洗脱，既避免了传统皂化中液液萃取中有机溶剂的大量使用，也简化了操作步骤，同时能满足一般奶粉样品的含量分析要求。

5.订货信息